ИФА (иммуноферментный анализ, ELISA – англ.) вошел в жизнь практической медицины еще где-то в 60-х прошлого столетия. Первоначальной его задачей были гистологические исследования в научных целях, которые сводились к поиску и идентификации антигенной структуры клеток живого организма.
В основе метода ИФА лежит взаимодействие специфических антител (АТ) и родственных антигенов (АГ) с образованием комплекса «антиген – антитело», который выявляют при помощи фермента. Этот факт натолкнул ученых на мысль, что метод может быть использован в диагностических целях для выявления специфических иммуноглобулинов различных классов, участвующих в иммунном ответе на ту или иную инфекцию. И это был прорыв в клинической лабораторной диагностике!
Активно использоваться метод начал только в начале 80-х и то, в основном, в специализированных учреждениях. Первыми иммуноферментными анализаторами были снабжены центры и станции переливания крови, инфекционные и венерологические стационары, поскольку рожденный на африканском континенте, появившийся на горизонте у нас и тут же примкнувший к «старым» инфекциям грозный СПИД, требовал незамедлительных мер диагностики и поиска лечебных препаратов, воздействующих на него.
Область применения метода ИФА
Возможности иммуноферментного анализа поистине обширны. Теперь и представить себе трудно, как можно обойтись без подобных исследований, применяемых буквально во всех отраслях медицины. Кажется, что может сделать ИФА в онкологии? Оказывается, может. И многое. Способность анализа находить маркеры, свойственные некоторым видам злокачественных новообразований, лежит в основе раннего выявления опухоли, когда другим способом она еще не определяется из-за своих небольших размеров.
Современная клиническая лабораторная диагностика (КДЛ), кроме онкомаркеров, располагает значительным арсеналом панелей для ИФА и использует их для диагностики различных патологических состояний (инфекционных процессов, гормональных нарушений) и мониторинга фармацевтических лечебных препаратов с целью выявления их влияния на организм больного и, кстати, не только человека. В настоящее время иммуноферментный анализ широко используется и в ветеринарной службе, ведь «братья наши меньшие» тоже подвержены многим заболеваниям, от которых, порой, очень сильно страдают.
Таким образом, ИФА, благодаря своей чувствительности и специфичности, по образцу крови, взятому из вены, может определить:
- Гормональный статус (гормоны щитовидной железы и надпочечников, половые гормоны);
- Присутствие вирусной и бактериальной инфекции (ВИЧ, гепатиты В и С, хламидиоз, сифилис, уреа- и микоплазмоз, герпетическая и TORCH-инфекции, а также многие другие болезни, вызванные патогенными микроорганизмами);
- Следы жизнедеятельности микроорганизмов, возбудивших инфекционный процесс, который благополучно закончился и перешел в стадию формирования иммунного ответа на этот возбудитель. Такие следы, то есть, антитела, во многих случаях остаются циркулировать в крови пожизненно, чем защищают человека от повторного заражения.
В чем суть ИФА?
Иммуноферментный метод, позволяет определить не только присутствие самого возбудителя (качественный анализ), но и его количественное содержание в сыворотке крови больного.
Вирусовая или бактериальная доза существенно влияет на течение инфекционного процесса и его исход, поэтому количественному анализу отведена не последняя роль в диагностике и лечении заболеваний в различных формах и стадиях.
Однако зная иммуноферментные исследования, как метод ИФА, мы даже не задумываемся, как же ему удается охватить такой широкий круг микроорганизмов, населяющих нашу планету, многие из которых несут прямую угрозу здоровью и жизни человека и животных. А дело в том, что ИФА имеет много вариантов (неконкурентный и конкурентный – прямой и непрямой), каждый из которых решает свою задачу и, таким образом, позволяет проводить целенаправленный поиск.
Для выявления иммуноглобулинов того или иного класса используется традиционная 96-луночная полистироловая панель (планшет), в лунках которой в твердой фазе сосредоточены сорбированные рекомбинантные белки. Попавшие в лунку с сывороткой крови антитела или антигены, находят «знакомый» объект и образуют с ним комплекс (АГ – АТ), который, закрепившись ферментным конъюгатом, при считывании результатов проявится изменением окраски лунки.
Иммуноферментный анализ проводится на тест-системах определенной специфичности, изготовленных в специальных лабораториях и укомплектованными всеми необходимыми реагирующими компонентами. Исследования можно проводить с помощью промывных аппаратов («вошеров») и считывающих спектрофотометров, где большей частью задействован ручной труд. На полных автоматах, освобождающих лаборанта от монотонного закапывания, промывания и прочих рутинных дел, конечно, работать быстрее и удобнее, но не все лаборатории могут позволить себе такую роскошь и продолжают работать по старинке – на полуавтоматах.
Интерпретация результатов ИФА находится в компетенции врача лабораторной диагностики, при этом обязательно берется в расчет и присущее практически всем иммунохимическим реакциям свойство давать ложноположительные или ложноотрицательные ответы.
Видео: современное проведение иммуноферментного анализа
Результаты ИФА на примере сифилиса
Иммуноферментный анализ подходит для выявления всех форм сифилиса, а, кроме этого, применяется в проведении скрининговых исследований. Для проведения анализа используют венозную кровь пациента, взятую натощак. В работе используются планшеты с определенной специфичностью (АТ классов А, М, G) или суммарные антитела.
Учитывая то, что АТ при сифилисе продуцируются в конкретной последовательности, ИФА может легко ответить на вопрос, когда произошло заражение и в какой стадии находится процесс, а расшифровка полученных результатов может быть представлена в следующем виде:
- IgM указывают на продолжительность инфекционного процесса (могут появляться при обострении хронических воспалительных заболеваний);
- IgA констатируют, что заражение случилось более месяца назад;
- IgG свидетельствуют о том, что инфекция находится в самом разгаре или о проведенном недавно лечении, что легко выясняется при сборе анамнеза.
При проведении анализа на сифилис, лунки с отрицательным ответом (и отрицательный контроль) останутся бесцветными, в то время как положительный результат (как и положительный контроль) даст ярко-желтое окрашивание за счет изменения цвета хромогена, добавленного в ходе исследования. Однако интенсивность окраски не всегда совпадает с контролем, то есть, она может быть немного бледнее или слегка желтоватой. Это сомнительные результаты, которые, как правило, подлежат повторному исследованию с обязательным учетом количественных показателей, полученных на спектрофотометре, но в целом, окраска находится в прямо пропорциональной зависимости от количества иммунных комплексов (связанные между собой АГ и АТ).
Самый волнительный из иммуноферментных анализов – ИФА на ВИЧ
Анализ на ВИЧ, пожалуй, больше других интересен широкому кругу населения, ведь пока нельзя с уверенностью утверждать, что исчезли многие социальные проблемы (проституция, наркомания и др.). К сожалению, ВИЧ затрагивает не только эти слои человеческого общества, заразиться можно при различных обстоятельствах, не связанных с половой распущенностью или приемом наркотиков. Но коль возникла необходимость обследования на ВИЧ, то бояться не следует, что все вокруг узнают о посещении такой лаборатории. Сейчас ВИЧ-инфицированные люди защищены законом, а сомневающиеся могут обратиться в анонимные кабинеты, где можно решить проблему, не боясь огласки и осуждения.
Иммуноферментный метод, применяемый для диагностики ВИЧ инфекции, относится к первостепенным стандартным исследованиям, которые, однако, требуют особых условий, поскольку тема очень деликатная.
ИФА на ВИЧ имеет смысл проводить после полового контакта, переливания крови, других медицинских манипуляций, предполагающих заражение, и по окончании инкубационного периода («серонегативное окно»), но следует учитывать, что этот промежуток времени не является постоянным. Он может закончиться через 14-30 дней, а может продолжаться до полугода, поэтому средним значением принято считать интервал от 45 до 90 дней. На ВИЧ кровь сдают так же, как и на другие инфекции – из вены на голодный желудок. Результаты будут готовы в зависимости от накопления материала в лаборатории и ее загруженности (от 2 до 10 дней), хотя чаще всего лаборатории обеспечивают получение ответа в тот же день или на следующий.
Что можно ожидать от результатов на ВИЧ?
ИФА на ВИЧ-инфекцию определяет антитела к двум разновидностям вируса: ВИЧ-1 (более распространенный в России и других странах Европы и Азии) и ВИЧ-2 (встречающийся чаще на территории Западной Африки).
Задачей ИФА ВИЧ является поиск АТ класса G, которые выявляются на всех тест-системах, но в более позднем периоде, и АТ классов А и М, выявляемых на рекомбинантных тест-наборах нового поколения, позволяющих найти антитела на самых ранних стадиях (инкубационный период – «серонегативное окно»). От ИФА можно ожидать следующие варианты ответов:
- Первичный положительный результат: кровь подлежит перепроверке на тест-системе такого же типа, но по возможности другой серии и другим человеком (лаборантом);
- Повторный (+) предполагает новый забор крови у пациента с исследованием ее подобно первичному анализу;
- Очередной положительный результат подлежит референтному анализу, при котором используются высокоспецифичные тест-наборы (2-3 шт.);
- Положительный результат в обеих (или в трех) системах направляется на иммуноблотинг (тот же ИФА, но выполненный в индивидуальном порядке на тест наборах особо высокой специфичности).
Заключение о ВИЧ инфицировании выносится только на основании иммуноблотинга. Проводится беседа с инфицированным в условиях полной конфиденциальности. Разглашение медицинской тайны в России, как, впрочем, и в других странах, подлежит уголовному наказанию.
ИФА находит хламидию, цитомегаловирус и даже паразитов
Анализы на хламидии и цитомегаловирус иммуноферментным методом также обрели особую популярность, ввиду того, что позволяют определить время заражения, стадию заболевания и эффективность лечебных мероприятий.
При внедрении хламидии тоже можно наблюдать появление антител различных классов в разных фазах патологического состояния, вызванного инфекционным агентом:
- IgM могут обнаружиться уже дней через семь после заражения;
- IgA говорят о том, что инфекция в организме живет уже более месяца;
- IgG подтверждают диагноз хламидиоза, помогает следить за лечением и определить его действенность. Следует заметить, что антитела класса G остаются и циркулируют в организме независимо от давности болезни, поэтому для правильной расшифровки анализа нужно принимать во внимание референтные значения (нормы), которые, кстати, для каждой КДЛ свои: с учетом марки тест-системы и специфичности реагентов, входящих в набор. Значения нормы вписываются в бланк рядом с результатом ИФА.
Что касается цитомегаловируса (ЦМВ), то здесь несколько иначе: антитела класса М появляются приблизительно через месяц-полтора, то есть, положительным результат (IgM+) становится в фазе первичного инфицирования или при реактивации скрытой инфекции и остается таковым от 4 месяцев до полугода.
Наличие АТ класса G характерно для начала первичной острой инфекции или реинфекции. Анализ констатирует, что вирус имеет место, однако информации, в какой стадии находится инфекционный процесс – не дает. Между тем, определение нормы титра IgG тоже вызывает затруднения, так как она целиком зависит от иммунного статуса конкретного человека, который, впрочем, устанавливается выявлением иммуноглобулинов класса G. Учитывая такое поведение антител, при диагностике ЦМВИ возникает необходимость в оценке способностей антител класса G взаимодействовать с ЦМВ, чтобы потом «обезвредить» его (авидность АТ). На начальном этапе болезни IgG очень плохо связываются с антигенами вируса (низкая авидность) и лишь потом начинают проявлять активность, стало быть, можно говорить о повышении авидности антител.
Алгоритм ИФА-исследований при подозрении на ЦМВ
Что такое паразиты – вряд ли стоит рассказывать, ведь они преследуют человека, начиная с детского возраста и, в полном смысле слова, отравляют ему жизнь (продукты жизнедеятельности паразитов очень ядовиты). Они бывают внушительных размеров (гельминты, а попросту – глисты) или маленькие (амебы, трихомонады, лямблии).
До появления в клинической лабораторной диагностике иммуноферментного метода найти паразитов было весьма сложно, теперь же, как говорят: «Нет проблем!». А все потому, что есть ИФА, который отыщет паразита, в какой бы форме тот не пребывал (цисты, личинки, яйца или взрослая особь) и в какой бы части человеческого тела не находился. Для этого нужно лишь взять кровь из вены и найти антитела, которыми организм уже ответил на чужеродные антигены.
О достоинствах иммуноферментного анализа можно говорить долго и много, ведь этот метод сумел решить многие диагностические задачи, используя лишь венозную кровь. Не нужно долгих ожиданий, волнений и проблем с забором материала для исследования. К тому же тест-системы для ИФА продолжают совершенствоваться и не за горами тот день, когда тест выдаст 100% достоверность результата.
